釀酒酵母表面原位合成β-環(huán)糊精輔助外流和高產(chǎn)β-香樹脂醇
作者：本站編輯
2023-01-11 06:42:52
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DOI：10.1002/bit.28327
雜志：Biotechnology and Bioengineering
作為多種植物五環(huán)三萜生物合成的關(guān)鍵中間體，β-香樹脂醇因其抗氧化活性在食品與醫(yī)藥行業(yè)中有著廣泛應(yīng)用根盒。目前，β-香樹脂醇已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了在釀酒酵母中的異源合成估态。然而虚育，該化合物是使用重組釀酒酵母以較低的克數(shù)在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，這限制了工業(yè)應(yīng)用凉适。細(xì)胞內(nèi)積累被認(rèn)為是達(dá)到更高滴度和簡(jiǎn)化提取過程所面臨的關(guān)鍵挑戰(zhàn)蛛蒙。為解決此問題，作者在先前的實(shí)驗(yàn)中使用了兩親性β-環(huán)糊精(β-CD)輔助β-香樹脂醇的流出渤愁。然而牵祟，培養(yǎng)基中補(bǔ)充的β-CD與β-香樹脂醇的合成不一致，并且具有成本較高的缺點(diǎn)抖格。因此诺苹，本研究開發(fā)了一種基于β-CD 原位合成的輔助外排系統(tǒng)，以增強(qiáng)β-香樹脂醇的生物合成及其外排雹拄。結(jié)果合成的 β-CD 可以捕獲16%的細(xì)胞內(nèi)β-香樹脂醇收奔，并將總產(chǎn)量提高77%掌呜。此外，還采用了包括誘導(dǎo)系統(tǒng)重塑坪哄、前體供應(yīng)增強(qiáng)质蕉、兩相發(fā)酵和脂質(zhì)合成調(diào)節(jié)等策略，使得搖瓶中β-香樹脂醇的產(chǎn)量增加到73 mg/L翩肌，比原菌株高31倍模暗。總的來說摧阅，這項(xiàng)工作為工程釀酒酵母中具有高疏水性的天然產(chǎn)物的輔助流出提供了新的策略寺癌。1.釀酒酵母表面β-環(huán)糊精(β-CD)原位合成的設(shè)計(jì)
為了實(shí)現(xiàn)釀酒酵母表面β-環(huán)糊精(β-CD)的原位合成，作者選用了含有表面展示的Aga1p-Aga2p錨對(duì)的商業(yè)釀酒酵母菌株EBY100作為平臺(tái)铣啰。其中绅荒，Aga1p可以通過β-1,6-葡聚糖鍵瞄定到細(xì)胞壁上，而Aga2p則可以通過兩個(gè)二硫鍵與Aga1p組裝并與目標(biāo)蛋白融合肌搔，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的表面展示肝羊。基于此伪浅，作者構(gòu)建了重組質(zhì)粒pYD1-FLAG-cgt并將其導(dǎo)入EBY100菌株子特，以便將CGT編碼的目標(biāo)蛋白CGTase（催化可溶性淀粉生成β-CD）融合到Aga2p的C末端，并將FLAG標(biāo)簽插入到CGTase的N末端用于免疫熒光測(cè)定惕衩。值得注意的是挨伯，Aga1p與融合蛋白Aga2p-CGT均在半乳糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子Gal1控制下表達(dá)。結(jié)果顯示协超，在最佳誘導(dǎo)條件20°C下由半乳糖誘導(dǎo)后履绎，Aga1p和Aga2p-CGT表達(dá)并分泌出來，其中雕什，Aga1p錨定在細(xì)胞壁上缠俺，并通過兩個(gè)二硫鍵與Aga2p-CGT特異性組裝。免疫熒光測(cè)定中也成功在工程菌株的表面觀察到清晰的綠色熒光贷岸，證實(shí)了上述結(jié)論壹士。由于β-CD不僅捕獲β-香樹脂醇，還捕獲酵母細(xì)胞中的角鯊烯和其他脂質(zhì)偿警，β-CD被進(jìn)一步設(shè)計(jì)為在培養(yǎng)的后期產(chǎn)生躏救。如圖所示，當(dāng)誘導(dǎo)后培養(yǎng)時(shí)間為36 h時(shí)螟蒸，僅在培養(yǎng)基中上清液中產(chǎn)生高濃度β-CD落剪，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間超過60 h時(shí)，則未能檢測(cè)到β-CD尿庐；而細(xì)胞表面展示產(chǎn)生的β-CD則在培養(yǎng)36至60小時(shí)內(nèi)逐漸增加忠怖，這可能是由于分泌的CGTase逐漸錨定呢堰。這一現(xiàn)象表明，與分泌型酶相比凡泣，表面展示的CGTase可以在更長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)持續(xù)產(chǎn)生β-CD枉疼。此外，隨著誘導(dǎo)溫度從20℃增加到30℃谭扑，β-CD的產(chǎn)量明顯下降窟句，說明較高的溫度不利于CGTase的分泌和表面展示。2.?原位合成β-CD捕獲細(xì)胞內(nèi)β-香脂樹醇
為了判斷原位合成β-CD捕獲細(xì)胞內(nèi)β-香樹脂醇是否可行优诵，作者在上述工程菌株EBY100-CGT中表達(dá)了來自光果甘草的β-香樹脂醇合酶bAS吟筷，以實(shí)現(xiàn)酵母中β-香樹脂醇的異源合成∫├基于此冲驶，在搖瓶發(fā)酵過程中，將淀粉加入到培養(yǎng)基中用于β-CD合成译教，并通過在工程菌株EBY100-bAS-CGT杖扫、EBY100-CGT和EBY100-bAS（對(duì)照）中分別添加半乳糖來誘導(dǎo)表面展示系統(tǒng)。發(fā)酵72小時(shí)后拖揩，提取產(chǎn)物并進(jìn)行GC-MS檢測(cè)煎喘。結(jié)果顯示，成功在EBY100-bAS-CGT中檢測(cè)到了β-香樹脂醇的產(chǎn)生丽示，產(chǎn)量達(dá)到4 mg/L卫漫，比對(duì)照菌株高77%，且胞外β-香樹脂醇占總產(chǎn)量的16%肾砂；而對(duì)照菌株中則未檢測(cè)到細(xì)胞外β-香樹脂醇列赎。同時(shí)，β-CD只能在EBY100-bAS-CGT的培養(yǎng)基上清液中檢測(cè)到通今，產(chǎn)量為14 mg/mL，對(duì)照中則未能檢出肛根。這些結(jié)果表明辫塌，表面展示系統(tǒng)合成的β-CD確實(shí)有助于β-香樹脂醇的流出，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的產(chǎn)生派哲。然而臼氨，β-CD的包涵能力是非特異性的，需要更多的策略來減少其他化合物對(duì)β-CD的競(jìng)爭(zhēng)芭届。3.優(yōu)化β-CD合成以提高β-香樹脂醇的輔助流出和生產(chǎn)
為了簡(jiǎn)化發(fā)酵過程储矩，作者引入了基于Gal4的溫度敏感突變體Gal4M9（GAL1/2/7/10 啟動(dòng)子的激活劑），從而將天然半乳糖誘導(dǎo)系統(tǒng)重建為溫度誘導(dǎo)系統(tǒng)褂乍。具體而言持隧，Gal4表達(dá)盒在組成型啟動(dòng)子ACT1控制下被Gal4M9取代即硼，隨后將PGAL驅(qū)動(dòng)的GgbAS和AGA2-CGT表達(dá)盒分別整合到酵母染色體的GAL4和GAL80位點(diǎn)，得到菌株EBY102-120腕浴。選擇24℃作為誘導(dǎo)溫度圣谴，誘導(dǎo)CGTases的表達(dá)、分泌和表面展示阅六。如圖所示母赶，CGTases在24°C誘導(dǎo)下顯示在所得菌株表面。此外芒单，觀察到對(duì)β-香樹脂醇的細(xì)胞內(nèi)合成有明顯的拉動(dòng)作用万杉。同時(shí)，與菌株EBY100-bAS-CGT相比抗躺，菌株EBY102-120的生物量增加了50%奸冶。為了進(jìn)一步提高β-香樹脂醇的產(chǎn)量，異源基因ERG1（來自白色念珠菌）和內(nèi)源性tHMG1曙辛、ERG20夏植、ERG9被組成型強(qiáng)啟動(dòng)子在菌株EBY102-120的多拷貝NTS位點(diǎn)過表達(dá)，得到菌株EBY102-124移鸣。用淀粉培養(yǎng)后砸捏，β-香樹脂醇總產(chǎn)量增加到 46 mg/L，比EBY102-120高6倍隙赁；且細(xì)胞外檢測(cè)到 4 mg/L β-香樹脂醇垦藏，這是對(duì)照、不用淀粉培養(yǎng)的EBY102-124的10倍伞访。此外掂骏，細(xì)胞合成和額外添加β-CD的輔助流出效果無明顯差異，表明由表面展示的CGT酶原位合成的β-CD與外源添加的β-CD發(fā)揮了相似的作用厚掷。4.雙相發(fā)酵促進(jìn)β-CD輔助外排為了在發(fā)酵過程中回收β-CD以更好地運(yùn)輸弟灼，作者采用了雙相發(fā)酵，選擇疏水性溶劑肉豆蔻酸異丙酯（IPM）作為萃取劑冒黑，以迅速?gòu)?/span>β-香樹脂醇-β-CD復(fù)合物中提取β-香樹脂醇田绑，從而使β-CD為空，以進(jìn)行下一個(gè)輔助流出過程抡爹。當(dāng)通過改變溫度至24°C誘導(dǎo)EBY102-124時(shí)掩驱，IPM與可溶性淀粉一起添加到培養(yǎng)液中。培養(yǎng)結(jié)果顯示冬竟，IPM對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和CGTase的表面顯示沒有顯著影響欧穴。此時(shí)，EBY102-124的胞外β-香樹脂醇含量高達(dá)11mg/L悟津，是對(duì)照菌株的28倍山椎，而β-香樹脂醇的總產(chǎn)量則增加到了54mg/L吸坐，比對(duì)照菌株增加了20%。為了進(jìn)一步驗(yàn)證IPM對(duì)基于β-CD的β-香樹脂醇輔助外排功能文荚，作者將EBY102-124在添加和不添加淀粉的IPM培養(yǎng)基中培養(yǎng)鳍擎。如圖所示，細(xì)胞外產(chǎn)量?jī)H為2mg/L衬械，這表明IPM可以單獨(dú)從細(xì)胞中提取少量β-香樹脂醇祷罩，但提取不足。該結(jié)果證實(shí)了β-CD和IPM的協(xié)同作用辙霎，尤其是β-CD的循環(huán)過程隔抒，可以改善β-香樹脂醇的輔助外排。因此淋憋，β-CD可以被認(rèn)為是酵母細(xì)胞和IPM之間的重要運(yùn)輸工具课娃。5. 脂質(zhì)調(diào)節(jié)促進(jìn)β-CD輔助外排據(jù)報(bào)道，β-CD在包封過程中影響膜的滲透性和流動(dòng)性桃序，尤其是含有不飽和脂質(zhì)的膜杖虾。因此，可以改變膜組成以調(diào)節(jié)β-CD介導(dǎo)的β-香樹脂醇的流出媒熊∑媸剩考慮到上述報(bào)道的結(jié)果，菌株EBY102-124的膜含量通過過表達(dá)DGK1和OLE1以及敲除DGA1得到改善芦鳍。所構(gòu)建的菌株EBY102-140中β-香樹脂醇的胞內(nèi)產(chǎn)量沒有顯著差異嚷往，而胞外產(chǎn)量顯著增加至31 mg/L，導(dǎo)致總產(chǎn)量為73 mg/L柠衅。細(xì)胞外比率增加到42%皮仁，比EBY102-124高2倍。作者推測(cè)菲宴，DGA1的破壞和DGK1的過度表達(dá)可能會(huì)將DAG池拉向PA合成贷祈，而OLE1的過度表達(dá)會(huì)增加脂肪酸的不飽和度，從而導(dǎo)致β-香樹脂醇的輔助外排增強(qiáng)喝峦。實(shí)驗(yàn)證明势誊，膜脂質(zhì)的不飽和百分比沒有顯著變化，而中性脂質(zhì)的不飽和度增加颅网，證實(shí)了PA合成的調(diào)節(jié)影響了β-香樹脂醇的產(chǎn)生段卵，并增強(qiáng)了β-CD-IPM輔助的β-香樹脂醇在釀酒酵母中的流出蜈率。
在這項(xiàng)研究中翎憨，作者設(shè)計(jì)了一種生產(chǎn)β-CD的原位合成策略，以輔助β-香樹脂醇的流出魔辉。還采用了包括誘導(dǎo)系統(tǒng)重塑磨再、前體供應(yīng)增強(qiáng)借倘、兩相發(fā)酵和脂質(zhì)合成調(diào)節(jié)等策略，促進(jìn)了β-香樹脂醇的胞外產(chǎn)生莉遥。這些策略可為高疏水性產(chǎn)物的生物合成和輔助流出提供參考枣象。
李文娟?摘譯
