近日橄碾，Bioresource Technology在線發(fā)表了江南大學(xué)未來(lái)食品科學(xué)中心和生物工程學(xué)院陳堅(jiān)院士團(tuán)隊(duì)劉龍教授課題組的研究成果“Highly
efficient neutralizer-free L -malic acid production using engineered Saccharomyces
cerevisiae” (Sun et al., Bioresource
Technology, 2023. 370: 128580)遂跟。江南大學(xué)2018級(jí)博士生孫利為論文第一作者船殉，劉龍教授為論文通訊作者存哲。作為一種重要的化學(xué)品原料窥岩，有機(jī)酸廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥娩纱、食品添加劑和材料化學(xué)等行業(yè)么养。近年來(lái)群鞭，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)有機(jī)酸成為一種很有前景的生產(chǎn)方法估褐。然而，在微生物發(fā)酵有機(jī)酸的生產(chǎn)過(guò)程中刃纽，隨著其自身酸性產(chǎn)品的積累酝侯，導(dǎo)致發(fā)酵液pH的不斷下降（通常低于3.0），嚴(yán)重影響了細(xì)胞的代謝活性和生產(chǎn)效率烫止。目前蒋荚，工業(yè)上解決此類問(wèn)題的主要辦法是在生產(chǎn)過(guò)程中添加大量中和劑（如碳酸鈣、碳酸鎂馆蠕、氫氧化鈉或氨水等）期升，這不僅增加了下游分離純化工藝的難度，提高了生產(chǎn)成本互躬，還會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染播赁。因此，如何選育可耐受低pH
(<3.0) 的微生物進(jìn)而實(shí)現(xiàn)無(wú)(或少)中和劑的添加是長(zhǎng)期以來(lái)有機(jī)酸發(fā)酵工業(yè)亟需解決的一個(gè)關(guān)鍵難題和挑戰(zhàn)吼渡。針對(duì)上述關(guān)鍵難題容为，該研究以釀酒酵母（Saccharomyces
cerevisiae）為出發(fā)菌株，首先以L-蘋果酸和檸檬酸為選擇壓力寺酪，通過(guò)近1800代實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性進(jìn)化與篩選坎背，選育了一株可耐受pH
2.3的釀酒酵母突變株TAMC (圖1)。通過(guò)對(duì)耐酸釀酒酵母TAMC酸耐受的多樣性進(jìn)行分析寄雀，發(fā)現(xiàn)該突變株具有較強(qiáng)的耐酸廣譜性得滤，可耐受L-蘋果酸、檸檬酸疑惨、L-乳酸、丙酮酸抠建、富馬酸估掐、葡萄糖酸、衣康酸盛己、琥珀酸和丙酸等多種有機(jī)酸（圖2）船酗。在此基礎(chǔ)上质驻，以耐酸釀酒酵母TAMC為底盤細(xì)胞，通過(guò)代謝途徑重構(gòu)收泥、轉(zhuǎn)運(yùn)體工程等策略汁匪，實(shí)現(xiàn)了L-蘋果酸的高效合成。首先琐店，對(duì)釀酒酵母中L-蘋果酸合成效率最高的胞質(zhì)途徑進(jìn)行調(diào)控贩俺，通過(guò)強(qiáng)化關(guān)鍵基因、解除葡萄糖抑制等策略俊势，搖瓶上L-蘋果酸的產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高5.6倍洋魂，達(dá)到7.3 g/L（圖3）。并進(jìn)一步引入了粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces
pombe）來(lái)源的L-蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SpMae1喜鼓，L-蘋果酸產(chǎn)量提高至24
g/L副砍，但胞內(nèi)仍有5.8 g/L的累積（圖4）。為提高胞內(nèi)L-蘋果酸的外排效率庄岖，基于L-蘋果酸響應(yīng)系統(tǒng)對(duì)L-蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)行了改造豁翎，成功篩選出一個(gè)可顯著提高L-蘋果酸胞外轉(zhuǎn)運(yùn)效率的突變體SpMae1F253A，L-蘋果酸的胞外產(chǎn)量提升至73.6
g/L（圖4）隅忿。此外心剥，對(duì)突變體的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白突變體轉(zhuǎn)運(yùn)效率的提高可能與轉(zhuǎn)運(yùn)通道體積的擴(kuò)大有關(guān)（圖5）硼控。最后刘陶，優(yōu)化前體物質(zhì)丙酮酸的代謝流，L-蘋果酸的搖瓶產(chǎn)量達(dá)到81.8
g/L牢撼。在3-L發(fā)酵罐上進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵匙隔，在不添加中和劑的條件下，L-蘋果酸的產(chǎn)量達(dá)到232.9
g/L (目前報(bào)道的蘋果酸最高產(chǎn)量)熏版，轉(zhuǎn)化率為0.66
g/g葡萄糖纷责，生產(chǎn)強(qiáng)度為1.62 g/L/h，發(fā)酵結(jié)束時(shí)pH為2.8左右（圖6）系亭。該研究所選育的耐酸釀酒酵母菌株在其它種類有機(jī)酸的工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中也具有較大的應(yīng)用潛力剿哪。上述研究工作得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2021YFD2101000/2021YFD2101002）、國(guó)家自然科學(xué)基金（32021005晋合，32100439主厅，32070085）、中央高衅螅基本科研專項(xiàng)資金（JUSRP622004咒祠，JUSRP222007）等項(xiàng)目的資助。
圖1?耐酸釀酒酵母的進(jìn)化與篩選
圖2?耐酸釀酒酵母耐酸廣譜性分析
圖3
L-蘋果酸胞質(zhì)合成途徑的代謝調(diào)控
圖4
L-蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的改造與調(diào)控
圖5
L-蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其突變體的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析
圖6
L-蘋果酸合成前體的代謝流優(yōu)化及3-L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵
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